共聚焦顯微鏡是一種利用??激光點光源與空間針孔濾波技術??，實現(xiàn)對樣品??光學“斷層掃描”成像??的高分辨率顯微儀器。它通過物理手段排除離焦雜散光，顯著提升圖像對比度和分辨率，尤其適用于厚樣品的三維重構與活體動態(tài)觀測。
 

　　??一、核心原理??
 

　　??1點照明 & 點探測??
 

　　激光束聚焦為??微小光點??(衍射極限級)照射樣品。
 

　　發(fā)射光(熒光/反射光)通過??針孔，僅允許??焦平面信號??通過探測器，阻擋離焦背景光。
 

　　??2光學切片??
 

　　通過逐點掃描樣品平面，并逐層移動聚焦位置，獲得??系列二維薄層圖像??。
 

　　疊加所有切片可重建??三維立體結構??。?
 

　　二、 共聚焦顯微鏡核心優(yōu)勢
 

　　1.出色的光學切片能力與三維重建：
 

　　消除非焦面模糊，獲得樣品內(nèi)部特定深度的清晰圖像。
 

　　通過Z軸步進掃描，獲取一系列二維“光學切片”，經(jīng)計算機處理可精確重建樣品的三維結構。這是研究細胞器空間分布、組織形態(tài)、材料表面/內(nèi)部結構的基石。
 

　　2.高分辨率與高對比度：
 

　　X-Y分辨率接近光學衍射極限(~200 nm)，Z軸分辨率(~500 nm)顯著優(yōu)于寬場顯微鏡(~1000-2000 nm)。
 

　　“針孔效應”極大抑制背景噪聲，提升圖像信噪比(SNR)和對比度，尤其對厚樣本或弱熒光信號至關重要。
 

　　3.強大的多色熒光成像能力：
 

　　利用多種不同激發(fā)波長的激光器和精密的熒光分光探測系統(tǒng)(如聲光可調(diào)濾光器AOBS， 二向色鏡， 光譜探測器)，可同時對同一樣品中的多個不同標記物進行成像。
 

　　高級光譜拆分技術(線性拆分)可有效分離發(fā)射光譜高度重疊的熒光染料，實現(xiàn)更精確的多色分析。
 

　　4.活細胞成像工具：
 

　　點掃描(尤其共振掃描)和轉盤共聚焦為觀察活細胞內(nèi)快速、動態(tài)的生理過程提供了可能。
 

　　結合環(huán)境控制系統(tǒng)(溫控、CO?、濕度)，可在接近生理條件下對細胞進行長時間(數(shù)小時甚至數(shù)天)觀察，研究細胞遷移、分裂、信號轉導、藥物反應等。
 

　　5.定量分析平臺：
 

　　熒光強度定量分析(如蛋白表達量、離子濃度變化)。
 

　　共定位分析(研究分子間的空間關系)。
 

　　熒光漂白后恢復(FRAP)及其變種：研究分子流動性、相互作用、細胞器連通性。
 

　　熒光共振能量轉移(FRET)：檢測分子間相互作用距離(<10 nm)。
 

　　熒光壽命成像(FLIM)：提供分子微環(huán)境信息(如pH、離子濃度、分子結合狀態(tài))，是定量FRET的重要手段。
 

　　熒光相關光譜(FCS)/熒光互相關光譜(FCCS)：在極微小體積內(nèi)分析分子擴散系數(shù)、濃度、相互作用。
 

　　三、核心組件與技術
 

　　1.激光光源：
 

　　多譜線激光器： 提供多個固定波長的激發(fā)光(如405nm, 488nm, 561nm, 640nm)。
 

　　白光激光器(WLL)： 提供連續(xù)可調(diào)的激發(fā)波長，極大提升實驗靈活性。
 

　　飛秒/皮秒激光器： 用于多光子激發(fā)。
 

　　2.掃描系統(tǒng)：
 

　　振鏡掃描器： 核心組件，控制激光束在X-Y方向精確掃描。
 

　　共振掃描器： 用于高速掃描。
 

　　轉盤掃描器： 用于轉盤共聚焦。
 

　　3.探測系統(tǒng)：
 

　　光電倍增管(PMT)： 傳統(tǒng)探測器，靈敏度高。
 

　　混合探測器(HyD)： 結合PMT高增益和雪崩二極管(APD)高量子效率、低噪聲。
 

　　雪崩光電二極管(APD)： 速度快，用于FLIM/FCS等。
 

　　科學級sCMOS相機： 用于轉盤共聚焦、光片、寬場超分辨。
 

　　4.分光系統(tǒng)：
 

　　聲光可調(diào)濾光器(AOTF)： 快速、精確調(diào)節(jié)激光強度和波長。
 

　　聲光分束器(AOBS)： 利用聲光效應進行高效、快速、無串擾的分光(替代二向色鏡，徠卡TCS核心)。
 

　　二向色鏡/濾光片輪： 傳統(tǒng)分光元件。
 

　　光譜探測器： 收集發(fā)射光的光譜信息，用于光譜拆分。
 

　　5.精密物鏡：
 

　　高數(shù)值孔徑(NA)油鏡、水鏡、甘油鏡、硅油鏡、空氣鏡。
 

　　復消色差(APO)物鏡。
 

　　長工作距離(WD)物鏡。
 

　　專用物鏡(如活細胞專用、多光子專用、TIRF專用)。
 

　　6.軟件平臺：
 

　　核心控制： 硬件控制(激光、掃描、探測、載物臺、Z軸)、圖像采集。
 

　　圖像處理與分析： 去噪、反卷積、3D/4D可視化、定量分析(強度、共定位、形態(tài)、FRAP、FRET、FLIM、FCS等)。
 

　　實驗管理： 多維實驗、宏編程、自動化。
 

　　代表軟件： 尼康NIS-Elements， 徠卡LAS X， 蔡司ZEN， 奧林巴斯cellSens。
 

　　四、 共聚焦顯微鏡應用領域
 

　　1.生命科學研究：
 

　　細胞生物學： 細胞器結構與動態(tài)(線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、細胞骨架)、細胞分裂、細胞遷移、囊泡運輸、信號轉導、細胞間通訊。
 

　　神經(jīng)科學： 神經(jīng)元形態(tài)(樹突棘、軸突)、突觸結構與功能、神經(jīng)回路、鈣成像、神經(jīng)遞質釋放。
 

　　發(fā)育生物學： 胚胎發(fā)育、組織形成、器官發(fā)生(活體成像)。
 

　　免疫學： 免疫細胞遷移、免疫突觸形成、病原體-宿主細胞相互作用。
 

　　微生物學： 細菌/真菌形態(tài)、生物膜結構、病原體侵染過程。
 

　　藥理學與藥物開發(fā)： 藥物靶點定位、藥物細胞內(nèi)分布、藥效評估(如細胞凋亡、增殖)、高通量篩選(轉盤共聚焦)。
 

　　2.臨床醫(yī)學：
 

　　病理學： 組織切片的高分辨率、高對比度成像(尤其熒光標記的特定蛋白或核酸)，輔助診斷。
 

　　眼科： 角膜、視網(wǎng)膜成像。
 

　　輔助生殖： 胚胎質量評估(非侵入性)。
 

　　3.材料科學：
 

　　表面形貌與粗糙度分析： 高精度三維表面成像。
 

　　薄膜與涂層分析： 厚度測量、均勻性、缺陷檢測。
 

　　聚合物科學： 相分離結構、結晶形態(tài)、添加劑分布。
 

　　半導體與微電子： 器件結構、線路檢查、缺陷定位。
 

　　地質與礦物學： 礦物成分分布、孔隙結構分析。
 

　　法醫(yī)學： 微量物證(纖維、油漆、粉塵)的精細結構觀察和成分分析。